Clases

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Técnicas de Estudio del ADN

Hibridación de ácidos nucleicos

Para conocer el grado de similitud entre 2 moléculas de ADN se procede como sigue:

• Se desnaturalizan con calor las moléculas de ADN.
• Se hidrolizan.
• Se mezclan.
• Se enfría la mezcla.
• Se averigua el porcentaje de moléculas de ADN bicatenario híbrido que se han formado; estas se pueden detectar marcando previamente una de las dos moléculas de ADN que se comparan con isótopos radiactivos: aquellas que tengan una radiactividad intermedia entre la máxima y la mínima serán las moléculas híbridas.

Cuanta más cantidad de fragmentos de ADN bicatenario híbrido se hayan formado durante la renaturalización, más parecidas sean las moléculas que se comparan.

Esta técnica se puede utilizar para...

• comparar el ADN de dos posibles familiares (p.e. en pruebas de paternidad, de hermanos separados de niños o de descendientes de personajes históricos);
• comparar el ADN de un sospechoso con el encontrado en el lugar de un crimen (medicina forense);
• comparar el ADN de especies vivas o fósiles y poder así establecer su grado de parentesco (p.e. neandertales con humanos modernos);
• diagnosticar una enfermedad de origen genético (hereditaria, cáncer, infección vírica): se secuencia el gen causante de tal enfermedad; se fabrica una sonda de ADN monocatenario con la secuencia de un fragmento del gen, marcada con fluorescencia; se mezcla con el ADN desnaturalizado del paciente, fijado en una placa multipocillo; se lava; si se detecta fluorescencia en la placa es porque ha habido hibridación entre la sonda de ADN y el ADN del paciente, en cuyo caso se diagnosticará la presencia del gen en el paciente.

Secuenciación de ácidos nucleicos

Son técnicas que permiten conocer la secuencia exacta de nucleótidos del ADN de un ser vivo. Gracias a ellas, el Proyecto Genoma Humano consiguió secuenciar el genoma de nuestra especie en el año 2000. A partir de ello se consiguió elaborar el atlas del genoma humano, que muestra...

• la ubicación en cada cromosoma de cada uno de nuestros genes;
• que nuestro genoma de referencia tiene 20.440 genes codificantes (los que portan información que acaba traduciéndose en proteínas), un 2% de nuestro genoma;
• que nuestro genoma de referencia tiene 23.995 genes no codificantes (los que codifican para ARN que no se traduce a proteínas: ARNt, ARNr, mirco ARN y ARNlnc), un 2% de nuestro genoma.
• que el resto de nuestro genoma está formado mayoritariamente por pseudogenes, transposones y diversas familias de ADN repetitivo.

Esta técnica se puede utilizar para...

• comparar el ADN de especies diferentes de seres vivos con mucho mayor grado de exactitud que por hibridación y así poder dilucidar bien sus relaciones filogenéticas (como cuando se descubrió que la vida estaba organizada en 3 grandes dominios: arqueas, bacterias y eucariontes);
• identificar a los genes causantes de enfermedades hereditarias (propensión al cáncer, propensión al infarto...);
• identificar al microorganismo causante de una gran mortandad en el pasado (Salmonella enterica como causante del cocoliztli en Centroamérica tras la llegada de los españoles).

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Para obtener numerosas copias de un fragmento de ADN de forma fácil, rápida y económica, se procede como sigue:

• Se desnaturaliza con calor la molécula de ADN.
• Se enfría y se añade una molécula muy corta de ADN monocatenario complementaria de la región del extremo 3' de cada una de las 2 hebras separadas; esta molécula actuará como cebador de la ADN-polimerasa.
• Se añade ADN-polimerasa resistente al calor (la polimerasa Taq, obtenida de una arquea hipertermófila) y las 4 clases de desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP) del ADN, con el resultado de la extensión completa de los cebadores por su extremo 3'.

Si el proceso se repite "n" veces, obtendremos 2ⁿ copias de la molécula original.

Esta técnica se puede utilizar para...

• amplificar el número de copias de un ADN valioso y escaso (p.e. ADN de fósiles o del lugar de un crimen);
• amplificar el ADN tomado de un paciente antes de utilizar una sonda de ADN para detectar en él una enfermedad hereditaria, tumoral o vírica (p.e. CoVid).

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Técnicas de Manipulación del ADN

Consiste en la manipulación deliberada del genoma de un ser vivo para modificar su ADN y conferirle características fenotípicas nuevas.

Mutagénesis dirigida

Para provocar cambios en la secuencia de nucleótidos de un gen concreto.

Esta técnica se puede utilizar para...

• anular genes y observar qué alteraciones fenotípicas suceden, para así poder conocer la función de tales genes;
• alterar los aminoácidos de una proteína para así poder obtener variantes que resulten más eficientes como fármacos, detergentes, plaguicidas, etc.;
• alterar los aminoácidos de una proteína para así poder conocer el papel de tal aminoácido en la proteína (si es importante en su conformación, o en la unión a un sustrato, o...).

Tecnología del ADN recombinante

Se denomina también "Ingeniería Genética".

Permite crear nuevas moléculas de ADN a partir de fragmentos de ADN de orígenes diferentes (incluso de seres vivos de especies diferentes). Cuando estas moléculas de ADN recombinante se introducen en un ser vivo, este pasa a ser un organismo transgénico, y tendrá una característica fenotípica nueva, que de modo natural jamás habría expresado.

Herramientas básicas

• Las endonucleasas de restricción. Son enzimas que cortan ADN. Cada enzima reconoce una secuencia blanco concreta (típicamente de 6 pares de nucleótidos) y corta el ADN en o cerca de esas secuencias. Muchas hacen cortes escalonados que producen extremos sobresalientes de ADN de cadena sencilla que luego se vuelven a unir espontáneamente (se llaman extremos cohesivos). Otras producen extremos romos. Un ejemplo de las primeras es EcoRI.

• Las endonucleasas CRISPR-Cas. Son enzimas que cortan ADN. Para saber en dónde han de cortar, van asociadas a un fragmento corto de ARN que se utiliza como guía: cada vez que la enzima encuentra en el ADN una hebra complementaria de la guía de ARN, corta en ese lugar. Es un sistema natural de defensa de las bacterias y las arqueas contra las infecciones víricas: lo utilizan para amputarse el ADN que los virus insertan en el ADN bacteriano, al que reconocen porque en una infección previa por el mismo virus la bacteria consiguió generar esas guías de ARN por complementariedad de bases con el ADN vírico.

  Pero comoquiera que esas guías de ARN pueden ser cambiadas, los científicos pueden utilizar el sistema CRISPR-Cas para cortar el ADN en el lugar que ellos quieran, simplemente creando en el laboratorio una guía de ARN complementaria de la secuencia de nucleótidos del ADN de ese lugar y combinándola con una endonucleasa Cas. Así no se depende de la existencia de secuencias concretas en un ADN para poder cortarlo, como sucedía cuando sólo se conocían las endonucleasas de restricción.

  Más aún, tras el corte hecho en el ADN por CRISPR-Cas, este complejo enzimático lo repara añadiendo un fragmento corto de ADN en el punto de corte. Esto es lo que permite que los científicos hayan desarrollado métodos de usar CRISPR-Cas tanto para silenciar genes como para editar sus nucleótidos a voluntad.

• Las ligasas. Son enzimas que unen ADN. Si las 2 moléculas de ADN que queremos combinar las cortamos con una misma enzima de restricción que genere extremos cohesivos, se van a unir espontáneamente al formarse los puentes de hidrógeno entre las bases complementarias de una y otra molécula. Pero aún va a quedar un hueco entre nucleótidos adyacentes en cada una de las 2 hebras. Estos huecos los sellan las ligasas fabricando el enlace nucleotídico entre tales nuceótidos.

• Los vectores de clonación. Para llevar un gen de una célula a otra, primero hay que extraerlo del ADN de la célula donante con una endonucleasa y luego hay que poder introducirlo en la célula receptora de un modo tal que pueda expresarse en ella. Una forma habitual de conseguir esto último es combinarlo con otra molécula de ADN que haga de vehículo. Estos vehiculos son los vectores de clonación.

  Si la célula receptora es eucariótica, el vector ha de ser capaz de integrarse en un cromosoma; de otro modo sus genes, incluido el gen pasajero, no se van a expresar. Esta integración en un cromosoma conlleva el riesgo de que al hacerlo se silencie un gen necesario para el funcionamiento normal de la célula, transformándola, por ejemplo, en tumoral. Por eso el vector ha de ser escogido cuidadosamente.

  Las 2 clases de vectores más comunes son:

  • Los plásmidos. Cuando la célula receptora es una bacteria, una arquea o una levadura, el vector ideal es un plásmido, ya que al tener estos organismos plásmidos de forma natural, siempre va a expresar los genes que lleve, sin que haga falta que se integre en un cromosoma. Cuando la célula receptora es de una planta, el vector ideal es el plásmido Ti de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, porque tiene la tendencia natural a integrarse en los cromosomas de las células de las plantas; se utiliza una versión atenuada de Ti, a la que se le han anulado los genes de la virulencia, ya que de otro modo provocaría tumores en la planta receptora.
  • Los virus atenuados. Cuando la célula receptora es de un animal, un posible vector es un virus, porque tienen la tendencia natural a integrarse en los cromosomas de las células; se utiliza una versión atenuada del virus, a la que se le han anulado los genes de la virulencia, ya que de otro modo se multiplicaría dentro de las células receptoras y las acabaría lisando.
• Hay algunas alternativas al uso de vectores: las pistolas de genes (que disparan nanoesférulas de oro recubiertas de ADN con el gen que se quiere clonar), los liposomas (micelas lipídicas que encapsulan el ADN con el gen que se quiere clonar) o la microinyección directa del gen a clonar en una célula receptora.

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Procedimiento básico: clonación de un gen de una bacteria en otra

• Se extrae el gen de interés con una endonucleasa (de restricción o CRISPR-Cas); de ser posible, una que deje extremos escalonados.
• Se escoge un plásmido y se corta con la misma endonucleasa que el fragmento de ADN que lleva el gen de interés, de modo que sus extremos sean cohesivos y se nos forme el ADN recombinante (vector + gen pasajero) de forma espontánea, cuando los mezclemos en la misma disolución.
• Se sellan los huecos con ayuda de una ligasa.
• El plásmido ha sido previamente modificado de 2 formas:
  • de tenerlos, se le han anulado los genes de la virulencia por mutación dirigida;
  • de no tenerlo, se le ha introducido un gen marcador, para poder saber al final del proceso qué bacterias han recibido el ADN recombinante; habitualmente se utiliza el gen que codifica para la resistencia al antibiótico ampicilina.
• Se introduce el plásmido recombinante en las bacterias receptoras por simple transformación bacteriana, lo que se facilita permeabilizando las envolturas de la misma con un calentamiento brusco y breve.
• Se cultivan las bacterias en ampicilina: las no transformadas van a morir, las transgénicas serán las únicas que sobrevivan y se multipliquen.

Variación: clonación de un gen eucariótico en una bacteria

Cuando se clonan genes eucarióticos en bacterias, a los genes hay que eliminarles los intrones, ya que las bacterias no los reconocen y llegan intactos a los ribosomas, donde van a ser traducidos junto con los exones, produciendo así proteínas totalmente diferentes de la deseada.

Esto se consigue no clonando el gen eucariótico de interés extraído directamente del ADN de un cromosoma, sino el ARNm maduro transcrito a partir de ese gen, el cual ya no contiene intrones. Luego, ese ARNm se copia a ADN bicatenario con ayuda de la transcriptasa inversa de los retrovirus.

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Biotecnología Microbiana

La biotecnología comprende todos aquellos procesos tecnológicos que utilizan organismos vivos, sus capacidades o sus productos para servir a los intereses humanos: mejora agrícola, terapia génica, remediación medioambiental, producción de moléculas de interés (nutrientes, fármacos, insecticidas...), etc.

En ingeniería genética

• Cuando se corta ADN (para extraer un gen, por ejemplo) se hace con endonucleasas obtenidas de bacterias.
• Cuando se lleva un gen de un organismo a otro para conseguir organismos transgénicos, se hace dentro de un vector de clonación que lo introduzca en las células receptoras. Si el organismo receptor es una bacteria o una planta, el vector es un plásmido (tomado de bacterias, aequeas o levaduras); si es un animal, el vector puede ser un virus atenuado (normalmente un adenovirus).
• Cuando se lleva un gen de un organismo eucariótico a uno procariótico, se le han de extirpar los intrones. Para ello, en lugar de utilizar el gen original de ADN, se utiliza el ARNm maduro (sin intrones) codificado por éste, que luego es convertido a ADN bicatenario (ADN copia, ADNc). Esto se hace con una transcriptasa reversa tomada de un retrovirus (como el VIH).
• Cuando se crea el vector de ADN recombinante, sus 2 partes (el ADN del vector y el ADN pasajero) se unen con ayuda de ligasas obtenidas de bacterias.
• Cuando se amplifica el ADN con la técnica de la PCR, se utiliza la polimerasa Taq, obtenida de la arquea hipertermófila Thermus aquaticus.

En la industria alimentaria

• Fabricación del vino. Es una fermentación alcohólica llevada a cabo fundamentalmente por la levadura Saccharomyces cerevisiae, la cual fermenta la glucosa del mosto de la uva hasta el etanol del vino.
  Adicionalmente la vinificación se puede complementar en las regiones frías con la fermentación maloláctica que, al transformar el ácido málico en láctico, reduce la acidez del vino; esta es llevada a cabo por bacterias como Leuconostoc y Oenococcus.
• Fabricación de cerveza. Es una fermentación alcohólica llevada a cabo fundamentalmente por la levadura Saccharomyces cerevisiae, la cual fermenta la maltosa contenida en semillas de cebada recién germinadas (malta) hasta el etanol de la cerveza.
• Fabricación del pan. Es una fermentación alcohólica llevada a cabo fundamentalmente por la levadura Saccharomyces cerevisiae, la cual fermenta el almidón de la harina hasta etanol. El etanol se evapora al ser horneado el pan y el CO₂ producido hace que el pan sea esponjoso.
• Fabricación del vinagre. Es una respiración aeróbica llevada a cabo por bacterias de los géneros Gluconobacter y Acetobacter, las cuales oxidan el etanol del vino hasta el ácido acético del vinagre.
• Fabricación de productos lácteos. Es una fermentación láctica llevada a cabo por bacterias como Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus termophilus, las cuales transforman la lactosa de la leche en el ácido láctico del yogur, cuajada o queso.
  En la maduración de cada clase de queso pueden intervenir microorganismos adicionales que les den su sabor, olor y textura característicos, como el moho Penicillium en la elaboración de los quesos azules.
• Obtención de enzimas tales como la renina, empleada para cuajar la leche en la elaboración del queso, en sustitución del cuajo natural (obtenido del estómago de los rumiantes).
• Obtención de ácidos orgánicos tales como el ácido cítrico, empleado como conservante en alimentos y bebidas, a partir de almidón y de azúcares fermentados por el moho Aspergillus niger.
• Obtención de aminoácidos tales como el ácido glutámico, empleado como potenciador del sabor en alimentos y bebidas, por variedades manipuladas genéticamente de la bacteria Corynebacterium glutamicum.

En la industria química

• Obtención de enzimas tales como proteasas, amilasas y lipasas, empleadas en la fabricación de detergentes a partir de bacterias alcalófilas (pues los detergentes suelen trabajar a pH básico) o de arqueas termófilas (ya que presentan su máxima actividad a temperatura elevada, que es a la que suelen trabajar los detergentes).

En la sanidad

Producción de vacunas

La vacunas, que buscan llevar a una persona el antígeno contra el que se quiere inmunizar, tradicionalmente han contenido al microorganismo atenuado, muerto o a sus toxinas inactivadas (toxoides). Actualmente se tiende a producir por ingeniería genética vacunas que contengan bien al propio antígeno completo, bien alguno de sus epítopos, bien al ARNm que codifica para él.

• Ejemplo: se aísla el gen que codifica para un antígeno del virus de la hepatitis B con ayuda de endonucleasas de restricción; se inserta en un plásmido bacteriano con ayuda de ligasas; el plásmido se inserta en levaduras que se multiplican en grandes cultivos; éstas expresan el gen del antígeno, lo sintetizan en grandes cantidades y lo liberan al medio de cultivo; el antígeno es purificado y encapsulado en vacunas; su administración no causa enfermedad alguna, pero sí desencadena una respuesta inmunitaria que deja memoria, lo que permitirá responder eficazmente ante una infección real del virus.
• Ejemplo: se identifica el gen que codifica para un antígeno del virus del CoVid, se deja que se transcriba a ARNm; el ARNm se aísla y se amplifica en el laboratorio con una variante de la técnica de la PCR; se encapsula en vacunas; tras su administración, las células del paciente expresarán el antígeno vírico, lo que no causa enfermedad alguna, pero sí desencadena una respuesta inmunitaria que deja memoria, lo que permitirá responder eficazmente ante una infección real del virus.

Producción de antibióticos

Los antibióticos son sustancias antibacterianas naturales producidas por algunas especies de bacterias y de hongos (aunque algunos pueden modificarse químicamente a posteriori en el laboratorio para mejorar su eficacia). Para maximizar su producción se cultiva a los microorganismos que los producen en grandes reactores, en condiciones controladas (de nutrientes, de O₂, de pH, de temperatura...).

• Ejemplo: cultivo en reactores de cepas de Penicillium chrysogenum manipuladas genéticamente para que produzcan y excreten al medio grandes cantidades de penicilina fácil de purificar.

Producción de proteínas humanas en bacterias transgénicas

Se utilizan bacterias modificadas genéticamente a las que se les ha clonado un gen humano de interés. El procedimiento es así: se aísla el ARNm maduro (sin intrones) que codifica para la proteína humana de interés; se convierte en ADN bicatenario gracias a la transcriptasa reversa de un retrovirus; se inserta en un plásmido bacteriano con ayuda de ligasas; el plásmido se inserta en bacterias que se multiplican en grandes cultivos; éstas expresan el gen de la proteína humana, la sintetizan en grandes cantidades y la liberan al medio de cultivo; la proteína es purificada y encapsulada en medicamentos.

• Ejemplo: bacterias transgénicas que producen:
  • insulina (para tratar la diabetes);
  • hormona del crecimiento (para tratar el enanismo);
  • factores de coagulación (para tratar la hemofilia);
  • interferones (para tratar enfermedades víricas);
  • anticuerpos, llamados monoclonales, para fabricar sueros (para combatir toxinas bacterianas o de serpientes, infecciones...).

Diagnóstico de enfermedades de origen genético

Se puede utilizar para detectar la presencia de una enfermedad hereditaria (distrofia muscular), de un cáncer (hepatocarcinoma) o de una infección vírica (CoVid).

• Procedimiento: Se aísla el ARNm de una célula del paciente (el transcriptoma, que es más significativo y pequeño que el genoma), se purifica, se copia a ADN bicatenario con ayuda de la transcriptasa reversa, se amplifica por PCR, se desnaturaliza y se hidroliza en fragmentos pequeños que se fijan en una placa multipocillo. Por otro lado se tienen numerosas copias de una sonda de ADN, que es un fragmento del gen responsable de la enfermedad que se investiga, marcado con fluorescencia. Tras añadirlo a la placa y lavar, en el caso de que haya habido hibridación se detectará fluorescencia en algún pocillo al observarlo a la luz ultravioleta. La hibridación va a denotar la presencia en el paciente del gen patológico que se investigaba.

Terapia génica

La terapia génica se utiliza para tratar enfermedades genéticas, tales como las enfermedades hereditarias (anemia falciforme) o el cáncer. Hoy día se basa en el uso de las endonucleasas CRISPR-Cas modificadas de múltiples maneras para...

• degradar el alelo mutante (silenciamiento de genes);
• sustituir nucleótidos en el alelo mutante para revertirlo al estado de alelo funcional (edición de genes).

Las endonucleasas CRISPR-Cas pueden hacer su trabajo...

• dentro del paciente, en un órgano concreto, a cuyas células adultas se hacen llegar encapsuladas en micelas lipídicas (liposomas);
• fuera del paciente, en células madre extraídas de éste y reinsertadas tras la manipulación genética.

Ejemplo. La anemia falciforme y la beta talasemia son debidas a una mutación en el gen que codifica para la beta-globina adulta, uno de los componentes peptídicos de la hemoglobina, la cual resulta alterada gravemente. Sucede que los humanos tenemos otro gen que codifica para la beta-globina fetal, pero está inactivado en adultos por un gen represor. El procedimiento de curación consistió en (a) extraer células madre hematopoyéticas de los pacientes, (b) inactivar en ellas el gen represor del gen de la beta-globina fetal degradándolo con endonucleasas CRISPR-Cas y (c) reinsertar las células madre modificadas en los pacientes, las cuales pueden ahora volver a producir beta-globina fetal y, por lo tanto, hemoglobina funcional.

Ejemplo. Nuestras proteínas deterioradas han de ser degradadas; este proceso produce amoniaco, que en el hígado es transformado en urea, la cual es eliminada por la orina. La carbamoil-fosfato sintetasa es la enzima que transforma el amoniaco en urea. Su deficiencia causa trastornos neurológicos e incluso la muerte en los niños que la padecen. Esta deficiencia se debe a una mutación puntual en el gen que la codifica. El procedimiento de curación consistió en utilizar endonucleasas CRISPR-Cas diseñadas para efectuar una sustitución de un nucleótido por otro en el alelo mutante y transformarlo así en el alelo normal; las endonucleasas fueron encapsuladas en micelas lipídicas (liposomas) que las introdujeron en las células del hígado.

En la agricultura

• Plantas transgénicas. Se puede llevar a plantas de cultivo genes de interés procedentes de otras especies (otras plantas o bacterias). Esto se hace utilizando un plásmido bacteriano como vector del gen de interés o bombardeando a las plantas con nanoesférulas de oro recubiertas de ADN. Las plantas modificadas genéticamente pueden...
  • ser capaces de producir nutrientes adicionales, como aminoácidos, vitaminas o aceites (arroz, soja);
  • ser resistentes a herbicidas, de modo que estos se puedan utilizar sobre el cultivo para eliminar a todas las malas hierbas (soja y maíz que expresan una proteína bacteriana que las hace resistente al herbicida glifosato);
  • ser resistentes a plagas (soja que expresa una proteína bacteriana tóxica para insectos barrenadores);
  • ser resistentes a sequías (soja);
  • ser resistentes a heladas;
  • tener mayor rendimiento;
  • tener frutos de maduración más lenta, lo que aumenta sus posibilidades de distribución comercial.
• Obtención de biofertilizantes:
  • Cianobacterias fijadoras de nitrógeno, como Anabaena azollae, que vive dentro de un helecho, se utilizan en arrozales como fuente de amonio.
• Obtención de insecticidas biológicos:
  • La bacteria Bacillus thuringiensis produce una proteína no tóxica para los vertebrados, que actúa como un insecticida natural. Por ello las esporas de esta bacteria se han comercializado para ser pulverizadas sobre las hojas de las plantas de cultivo.

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En la obtención de materias primas

• Producción de biocombustibles:
  • Producción de biodiésel, etanol y metano con diatomeas y algas verdes unicelulares cultivadas en grandes reactores.
  • Producción de metano con arqueas metanógenas a partir de los residuos de los vertederos y de las depuradoras de aguas.
• Producción de plásticos biodegradables. Bacterias como Alcaligenes almacenan carbono en moléculas de poli-hidroxialcanoatos (PHA); estos son plásticos biodegradables que se pueden obtener de cultivos bacterianos y utilizarse para producir envases o tejidos.
• Biolixiviación. Se utilizan bacterias como Thiobacillus para solubilizar metales como el hierro o el cobre y así extraerlos fácilmente de de menas pobres.

En la preservación del medio ambiente

• Biorremediación. Es la eliminación de contaminantes con ayuda de otros seres vivos, a veces manipulados genéticamente. Cuando el organismo descontaminante es una planta, se habla de fitorremediación. Algunas posibilidades son:
  • La biodegradación, que es el consumo del contaminante para obtener de él energía, carbono... Un ejemplo es la utilización de bacterias quimioheterótrofas para eliminar vertidos de petróleo en el mar o insecticidas de un acuifero;
  • La bioextracción, que consiste en extraer contaminantes del medio y acumularlos en el cuerpo del organismo sin sufrir daño, como hacen los álamos con numerosos contaminantes disueltos en la humedad del suelo;
  • La bioadsorción, que consiste en inmovilizar contaminantes al quedar adheridos a la superficie de microorganismos, como la capa mucilaginosa de algunos mohos.
• Eliminación de residuos de las actividades humanas regulares:
  • Las basuras orgánicas son transformadas en compost por microorganismos, de un modo similar a la transformación de la necromasa en humus en el suelo de forma natural.
  • Las aguas residuales son depuradas por arqueas metanógenas.